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教你如何選擇融合蛋白接頭Linker

  • 發布時間:2018-09-07
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融合蛋白在分子生物學中的應用極為廣泛,最簡單的應用是在蛋白質的末端連上標簽,用于WB檢測或純化。復雜一些的應用則是將需要研究的目的蛋白與另一個標記蛋白連接:當標記蛋白為熒光蛋白時,可將目的蛋白的示蹤和圖像學分析;標記蛋白為白蛋白或者抗體Fc片段時,可用于延長目的蛋白的半衰期;又或者將兩個目的蛋白連接,用于研究他們的共同功能或者相互作用。

作為需要使用融合蛋白的科研工作者,了解一些必要的Linker知識,將使得您在設計質粒方面更加得心應手。本文將介紹一下天然形式下的蛋白Linker和目前應用最廣泛的人工合成Linker,以及他們的特性;其次介紹通過增加蛋白Linker實現的各種功能,包括提高折疊和穩定性,促進蛋白質表達,增加內在生物學活性;最后介紹如何使用在線工具設計Linker

我們通常將使用的蛋白Linker分為3種,分別為柔性Linker、剛性Linker以及可剪切(或自剪切)Linker

  

柔性Linker

最常見的柔性Linker就是GGly)甘氨酸和SSer)絲氨酸的GS組合,最常用的GS組合就是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n,通過改變n的大小,研究者可以將結構域之間的距離放大和減小,實現結構域分離(n2)或連接結構域,研究其相互作用。

其他一些常見的蛋白Linker具有一些特定的用途,例如單鏈可變片段(single chain variable fragment (scFv))中,連接重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的柔性Linker,通常為KESGSVSSEQLAQFRSLD EGKSSGSGSESKST。這些序列中甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)提供柔軟度,谷氨酸(Glu)和賴氨酸(Lys)提高水溶性。

更簡單粗暴一些的柔性Linker就是純甘氨酸(Gly)組成的(Gly)8,或短一點點的(Gly)6,它們的優點是在酵母表達純化過程中,能夠抵抗蛋白酶的水解,同時保護兩端蛋白結構域的功能活性。

 

剛性Linker

具有(EAAAK)n序列的α-螺旋形成的Linker具有內部氫鍵和密切聯系肽鏈骨干,剛性且穩定。因此,剛性α-螺旋Linker可作為蛋白質結構域之間的剛性間隔。通過將藍色熒光蛋白(EBFP)和綠色熒光蛋白(EGFP)連接在一起,評估熒光共振能量轉移(FRET)之間的效率,可以發現(EAAAK)n序列連接兩個熒光蛋白時,熒光共振能量轉移效率比(GGGGS)n序列低,說明α-螺旋Linker能夠有效的隔離兩個不同的蛋白結構域。

另一種類型的剛性Linker具有Pro-rich序列(XP)n,其中X可指定任何氨基酸,推薦選擇丙氨酸(Ala),賴氨酸(Lys)或谷氨酸(Glu)。(XP)n序列沒有螺旋結構,Linker中存在的脯氨酸(Pro)可以增加骨架硬度,并且有效分離結構域。富含脯氨酸序列的結構在機體中廣泛的存在,例如骨骼肌蛋白的N端就存在(Ala-Pro)7的結構。

剛性Linker表現出相對堅硬的結構,能夠有效的將兩端的蛋白結構域分開,通過改變n的大小,就能夠輕易調整結構域之間的最佳距離,從而保證兩端蛋白的活性與生物功能。

 

可剪切Linker

到目前為止討論的Linker通常不會在體內裂解。這些穩定的接頭共價連接兩個功能域,使得融合蛋白在體內變成一個蛋白。功能結構域之間的穩定連接提供許多優點,例如延長的血漿半衰期(例如白蛋白或Fc融合)。然而,它也有一些潛在的缺點,包括功能域之間的空間位阻,生物活性降低,以及由于域之間的干擾導致蛋白質部分的生物分布和代謝方式改變。在這些情況下,引入可剪切Linker,使得融合蛋白能夠在體內釋放,分離兩個功能結構域。

一個研究的比較透徹的過程是二硫鍵的還原。這個可剪切Linker序列為LEAGCKNFFPRSFTSCGSLE,基于二硫環肽,在接頭上的兩個半胱氨酸(Cys)殘基之間形成的分子內二硫鍵,同時這個序列對凝血酶敏感。在凝血酶的作用下能夠有效的對Linker中凝血酶敏感序列(PRS)進行切割。

其他比較流行的可剪切Linker,能夠不依賴蛋白酶,自行進行切割處理,使得兩個結構域斷裂。這些自剪切Linker通為2A短肽,通常在序列NPGP進行自剪切分離。2A短肽通常來源于病毒的蛋白質序列,例如P2A表示來源于豬捷申病毒(porcine teschovirus-1);E2A表示來源于馬鼻炎病毒(equine rhinitis A virus);F2A表示來源于口蹄疫病毒(Footand Mouth Disease Virus)。由于自剪切效率各有不同,2A短肽之間也存在一定差異,我們一般推薦使用P2AT2A序列。

如何設計Linker

隨著對天然多結構域蛋白中的Linker和重組融合蛋白的廣泛研究,研究者們萌生了構建數據庫的想法,提出了Linker設計工具,基于融合蛋白的期望特性來合理設計Linker。這種類型的工具的一個典型例子是名為synlinker的程序,該程序在用戶指定的輸入(例如Linker長度,要避免的蛋白酶敏感序列)中搜索其連接子序列的數據庫,并生成幾個連接子序列的輸出Linker數據庫是基于這樣的假設建立的,即在X射線晶體結構或NMR溶液結構中觀察到的環序列可能采用延伸構象作為融合蛋白中的Linker。最終的數據庫包含14,734個序列,它們包含PDB文件中的記錄,可自動識別蛋白質的二級和環狀結構。程序的基本輸入是Linker序列的期望長度,通常表示為殘基數量或以埃為單位的距離。額外的輸入參數包括,避免被蛋白酶或限制性內切酶切割,使得選擇的Linker在克隆過程中對特定蛋白酶穩定或序列對限制性內切酶具有抗性。使用者還可以加入氨基酸組成偏好(例如,消除疏水性殘基)以進一步選擇其感興趣的Linker。此程序可以作為生成Linker序列的工具,使用十分便利(http://synlinker.syncti.org/)。

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參考文獻

[1] Fusion proteinlinkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct;65(10):1357-69. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.039. Epub 2012 Sep 29.

[2] Effect oflinker flexibility and length on the functionality of a cytotoxic engineeredantibody fragment. J. Biotechnol. 2015. 199: 90-97.

[3] High cleavageefficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human celllines, zebrafish and mice. PLoS One. 2011; 6(4):e18556. doi:10.1371/journal.pone.0018556. Epub 2011 Apr 29.

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